Zeocin (Powder) 博萊霉素（粉末）

產品簡介：

Zeocin是一種作用于真核和原核細胞的選擇性抗生素。來自Streptoalloteichus hindustanus的Sh ble基因賦予Zeocin抗性，該基因編碼一種13,665Da大小的蛋白，以化學計量方式結合Zeocin，抑制其DNA雙鏈切割活性。因此，能表達此蛋白的真核和原核宿主細胞具有Zeocin抗性。

Zeocin是腐草霉素D1（Phleomycin D1）的商業名稱，是一種銅離子螯合的糖肽抗生素（來源于鏈霉菌Streptomyces verticillus的突變株），銅離子的存在使其呈藍色，此銅螯合的形式為無活性。當抗生素進入細胞后，二價銅離子（Cu2+）被還原為一價銅離子（Cu+），并被細胞內的巰基化合物去除。銅離子被去除后，Zeocin被活化，嵌入DNA使其斷裂，最終導致細胞死亡。Zeocin作用譜廣泛，對細菌、真核微生物、植物和哺乳動物細胞具很強的毒性。

Phleomycin (腐草霉素) (貨號：NBS2094)也是博來霉素家族的糖肽抗生素，其有效成分和Zeocin (博萊霉素)基本一致，都為Phleomycin D1，抗性基因也都為Sh ble。兩者的配方有一定的區別，Zeocin是以Phleomycin D1為主要成分的一種試劑，添加了不同的輔料，更適用于哺乳動物細胞的篩選；而Phleomycin是結構相似抗生素的混合物，它們的末端氨基有一定的區別，建議用于對Zeocin不敏感的細胞，如絲狀真菌和一些酵母等。

Zeocin對于絕大多數好氧細胞均有效，常用于細菌(如大腸桿菌)、真核微生物(如酵母)及動植物細胞的篩選。大腸桿菌篩選推薦濃度為25~50μg/ml (低鹽LB培養基，NaCl濃度不能超過5g/L)；酵母篩選推薦濃度為50~300μg/ml (YPD或基本培養基)；哺乳動物細胞篩選推薦濃度為50~1000μg/ml (根據細胞類型選擇合適的細胞培養液)。實際應用時，應針對不同的細胞系測試Zeocin的濃度梯度，以確定最佳使用濃度。

產品特性：

1） CAS NO.：11006-33-0

2） 外觀：藍色

3） 內毒素：＜1 EU/mg

4） 溶解性：易溶于水（>500 mg/ml）

5） 質量控制：分別對Zeocin敏感或Zeocin耐性的哺乳動物細胞測定抗生素活性。

保存條件: 

4℃干燥保存（一年有效）。

母液制備

1）將低溫保存的Zeocin置于室溫回溫至少20min，加入適量HEPES buffer（5g/L, pH 7.2±0.1），充分溶解，配制成100mg/ml溶液。

2）用0.22μm濾膜過濾除菌。

3）溶液置于4℃保存12個月有效，或-20℃保存，18個月有效。

操作步驟（以哺乳動物細胞為例）

【注1】：Zeocin的殺滅機制不同于新生霉素（neomycin）和潮霉素B（hygromycin B），細胞不會聚集成團和從培養板表面脫落。一旦接觸到Zeocin，敏感細胞會出現如下的形態變化：1）細胞體積明顯增加（類似于巨細胞病毒感染容納性細胞引起的腫大效應）；2）異常的細胞形狀包括細胞長臂（long appendages）出現；3）胞漿內出現大型空泡（源于內質網、高爾基體或支撐蛋白的破裂）；4）質膜和核膜破裂，導致膜上出現許多孔。這些敏感細胞最終會完全破損，僅僅以細胞碎片的形式存在。

【注2】：Zeocin抗性細胞按正常周期分化產生不同于敏感細胞的克隆?？剐约毎谛螒B上，與未接觸Zeocin的正常細胞沒有任何差異。

【注3】：Zeocin用于哺乳動物細胞篩選常用濃度為50-1000μg/ml（平均常用濃度為250-400μg/mL），影響篩選濃度的主要因素包括離子強度，細胞類型，細胞密度以及生長速率。以下步驟僅作參考，請根據自身實驗體系做適當調整。

一、細胞對Zeocin敏感性的確定（殺滅曲線建立）

1) 重新鋪板或者將滿盤細胞重新分盤，使得細胞密度約25%，按照8個平板/組準備，培養24h，去除舊培養基。

2) 加入含不同濃度Zeocin的篩選培養基，Zeocin濃度可設置為0, 50, 100, 200, 400, 600, 800和1000 μg/ml，每個濃度做3個平行；也可根據自身實驗體系，設置不同的濃度梯度。

3) 每3-4天更換新鮮的篩選培養基，并觀察存活細胞的比例。選擇在合適時間（1-2周內）殺死大多數細胞的濃度為最佳工作濃度?！咀ⅰ浚喝羰请y以在顯微觀察下區分活細胞，建議使用臺盼藍染色來計算存活細胞的數量，以確定Zeocin的最適濃度。

二、篩選穩定轉染細胞系

1) 轉染細胞，用100mm培養皿進行培養。以未轉染的細胞作為陰性對照。

2) 轉染后，用預熱的1X PBS洗滌一次，加入新鮮培養基。

3) 轉染48-72h后，用含有最佳濃度Zeocin（由滅殺曲線確定）的新鮮培養基篩選細胞。為了更好的鑒定和篩選細胞集落，建議將細胞按比例稀釋成一系列濃度。

【注】：若待篩選細胞對Zeocin的抗性明顯強于大部分細胞，按照以下方法克服此類耐性：用含Zeocin培養基進行細胞分盤，置于37°C孵育2-3h，使得細胞貼壁。然后將細胞置于4°C，2h。記得使用Hepes作為培養基的緩沖體系。重新將細胞置于37°C孵育。4°C孵育細胞的目的是短時間內終止細胞分化，使得Zeocin能發揮作用，殺死細胞。

4) 每3-4天更換新鮮的選擇培養基，直到出現細胞集落。

5) 挑選并轉移克隆到96或48孔板中。在進行更大孔徑培養板或培養皿上擴大培養之前，確保培養細胞密度近100%。

三、穩定轉染細胞系的維持培養

可采取以下方式維持培養穩定轉染細胞：

1）使用含相同劑量Zeocin的篩選培養基來維持培養；

2）降低Zeocin劑量為原來的一半進行維持培養；

3）使用正好能預防敏感細胞生長但不足以致死的Zeocin劑量來維持培養【根據殺滅曲線來判斷】。

Zeocin常用的工作濃度為100μg/ml，但是，最佳的工作濃度需要根據細胞類型和實際的實驗體系來確定。某些哺乳動物細胞的建議工作濃度列在下表：

注意事項：

1.      Zeocin粉末容易受潮，一定要注意干燥保存。每一次使用完后需蓋緊管子。

2.      Zeocin是一種不穩定化合物，在高pH和低pH或存在弱氧化劑的情況下會發生不可逆變性。

3.      Zeocin對高濃度酸和堿都很敏感，但短期暴露在弱酸下能耐受。

4.      Zeocin對光敏感，需將抗生素，或含該抗生素的平板或培養基置于黑暗處。

5.      Zeocin有毒，操作時需注意防護，切勿與身體或皮膚直接接觸。

6.      Zeocin?是Invivogen公司的商標產品。

7.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

常用篩選抗生素及其使用濃度: