IPTG 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷

產品簡介：

IPTG，英文全名Isopropyl-beta-D-thiogalactoside，中文全名異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，CAS NO：367-93-1，誘導細菌lac或tac操縱子調控的基因轉錄，尤其是水解酶β-半乳糖苷酶（β-gal，beta-gal）。一旦表達，β-gal水解β-半乳糖苷和乳糖為單糖。IPTG通常用于β-gal活性分析，當含大腸桿菌來源lacZ基因的載體轉染進入細胞后，編碼表達β-gal，細胞裂解后，通過催化底物ONPG的顏色反應即可定量分析活性。IPTG也是硫代半乳糖苷轉乙酰基酶的底物，文獻報道還能誘導合成細菌青霉素酶。體內研究IPTG的一個重要優勢在于，IPTG不會大腸桿菌所代謝，IPTG濃度和lac p/o控制基因表達都保持穩定。

IPTG誘導lacZ表達的作用機制:

1）lacZ操縱子（lacZ Operon）的概念

lac操縱子是調控大腸桿菌和其他一些細菌的乳糖轉運和代謝必需的一種操縱子，包含三種緊密連接的結構基因，lacZ，lacY和lacA。包括葡萄糖和乳糖等在內的幾種因素都可調控lac操縱子。

2）IPTG誘導lacZ表達的作用機制

lacZ基因是β-半乳糖苷酶（β-gal，beta-gal）表達的一種基因。IPTG作為一種非代謝性的半乳糖類似物，與lac repressor（lac阻遏物，乳糖阻遏物）結合，以變構形式釋放lac操作基因（lac operator）來源的四聚體阻遏物，從而允許lac操縱子上的基因轉錄，比如lacZ基因表達β-gal。克隆實驗IPTG誘導lacZ基因表達。IPTG是最常用的lac操縱子合成誘導劑，在極低濃度有活性，且不會受酶降解的影響。

IPTG的主要生理功能:

1）β-半乳糖苷酶（β-gal，beta-gal）活性檢測

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）由大腸桿菌lacZ基因編碼，是最常用的一種報告酶，用來研究哺乳動物細胞的基因表達，蛋白-蛋白相互作用，以及標準化轉染效率。

檢測原理：IPTG誘導lacZ基因表達β-半乳糖苷酶（β-gal），細胞裂解后，體系中加入無色的ONPG（鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷），被β-gal水解為鄰硝基苯酚（o-nitrophenol），生成黃色（420nm）。顏色反應的強度與β-gal活性成正比。

2）藍白斑篩選（Blue-white screening）

IPTG普遍用在需要誘導β-gal活性的克隆步驟中，最為常見的就是和X-gal聯合使用進行藍白斑克隆篩選，或與Magenta-gal聯合使用進行紅/白斑克隆篩選。

作用機理：當目的基因插入載體lacZ基因，破壞β-gal表達并阻止其表達。細菌在含X-gal的培養基上生長，β-gal水解此底物生成一不可溶藍色產物，菌落呈藍色。若β-gal不能表達，細菌克隆則無法催化X-gal底物，菌落呈白色，以此區分轉化重組載體或非重組載體的克隆子。

3）重組蛋白的誘導表達

IPTG也可用于重組蛋白的誘導表達。在這些體系中，待研究蛋白在IPTG誘導型啟動子下游編碼。IPTG誘導待研究蛋白表達，對細胞裂解后，使用一系列合適方法來純化蛋白，如His-tag或GST-tag純化系統（融合相應標簽的重組蛋白）。

IPTG產品特性：

1）CAS NO：367-93-1

2）英文同義名：Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside; Isopropyl β-D-thiogalactoside; IPTG;

3）中文同義名：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷；異丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷；

4）分子式：C9H18O5S

5）  分子量：238.30 g/mol

6）  純度：≥99%（基于干重，HPLC）

7）  外觀：白色結晶粉末

8）  雜質：≤0.1% Dioxane（二氧六環）

9）  溶解性：溶于水、乙醇

10）化學結構圖：

保存條件: 

-20℃保存（5年有效）

產品使用：

1. IPTG儲存液配制

稱取0.238g IPTG溶于10ml去離子水中，充分溶解混勻后，經0.22μm濾膜過濾除菌，即得到100mM（100×）的儲存液。按照1ml/管分裝，置于-20℃凍存，高達一年穩定。

2. 藍白斑篩選方法

方法1：X-Gal、IPTG加入固體培養基（推薦）

1）高壓滅菌已加瓊脂的培養基，并冷卻到50℃左右；

2）每ml培養基內加入10μl 20mg/ml X-gal溶液、10μl 100mM IPTG（使其終濃度達到1mM）；

3）加入適量篩選抗生素如氨芐青霉素，卡那霉素，羧芐青霉素等；

4）混勻后倒板，置于無菌超凈臺內使培養基凝固（通常需要30min）。

5）將轉化的感受態細胞涂布到上述平臺，于37℃倒置培養過夜，觀察藍白斑情況。

方法2：X-Gal、IPTG直接涂布平板表面

1）于無菌超凈臺內干燥倒好的平板；

2）加120μl 20mg/ml X-gal溶液、40μl 100mM IPTG到平板表面，并涂布均勻覆蓋整個平板；

3）于無菌超凈臺內干燥上述平板，至少需要30min；

4）將轉化的感受態細胞涂布到上述平臺，于37℃倒置培養過夜，觀察藍白斑情況。

方法3：X-Gal、IPTG加入上層培養基（噬菌體）

1）高壓滅菌已加瓊脂（0.7%）的培養基，并冷卻到50℃左右；

2）每3ml培養基內加入40μl 20mg/ml X-gal溶液、25μl 100mM IPTG；

3）加入細菌和噬菌體混合物，翻轉離心管使快速混勻，然后倒入上層平板鋪平。

4）于30℃培養過夜，觀察藍白噬菌斑情況。

3. IPTG誘導重組蛋白的表達

細菌重組蛋白用IPTG誘導表達，有兩種基本方法，一種是快速誘導法，并非適合所有蛋白，且產量并非最理想。另一種是慢誘導法，能增強一些蛋白的可溶性。根據具體要求來選擇合適方法。

方法1：快速誘導法

1）從一個相對新鮮平板上挑取一個克隆，接種到含Amp的1-2ml LB培養液，裝入15ml離心管，30°C (or 37°C)于搖床培養過夜；

2）按照1:50（37°C培養1:100）的比例稀釋到2ml含Amp的LB培養液，裝入15ml離心管，37°C于搖床培養3-4h；

3）提前準備1ml LB+Amp+1mM IPTG，裝入15ml離心管內，并在使用前15min于37°C預熱；

4）從步驟2中培養3-4h的培養液中吸取1ml，裝入1.5ml離心管。室溫超速離心30s，去除上清液。將菌體沉淀物置于-20°C待用。【此為未誘導對照】

5）將預熱的1ml LB+Amp+1mM IPTG加到上述培養物中，重新置于37°C培養3-4h；此時培養總體積2ml，IPTG終濃度未0.5mM。

6）從步驟5中培養3-4h的培養液中吸取1ml，裝入1.5ml離心管。室溫超速離心30s，去除上清液。將菌體沉淀物置于-20°C凍存。【此為誘導樣本】

7）SDS-PAGE檢測樣本：加入100ul 1X loading buffer（含1% BME）到未誘導和誘導樣本中。漩渦混我10s-1min，或直至看不到細菌團。煮沸3-5min，超速離心30s。

方法2：慢速誘導法

1）—4）步驟同上；

5）將20°C的1ml LB+Amp+1mM IPTG加到上述培養物中，重新置于20°C培養12-16h；此時培養總體積2ml，IPTG終濃度未0.5mM。

6）從步驟5中培養12-16h的培養液中吸取1ml，裝入1.5ml離心管。室溫超速離心30s，去除上清液。將菌體沉淀物置于-20°C凍存。【此為誘導樣本】

方法3：可溶性蛋白的提取

1）用2ml冰STE（10mM Tris，pH 8.0；150mM NaCl；1mM EDTA；）洗滌細菌沉淀物一次；

2）重懸細菌沉淀物（10ml誘導培養物），用800ul含100ug/ml溶菌酶的STE；（溶菌酶必須重懸前即刻加入）；

3）冰浴15min；

4）加入DTT（貨號：NBS2061-10g）使其終濃度未5mM；

5）加入蛋白酶抑制劑（貨號：NBS0001-1ml）。

注意事項：

1.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。